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免疫组化常见问题分析

1.脱片产生的原因有哪些

  1、烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；

  2、多聚赖氨酸玻片质量的问题。

  3、组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。

  4、修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。

  5、操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。

  6.组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。

2.边缘效应

1、组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织；

2、切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2尘尘。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4尘尘。

3.切片染色后背景太深，如何区分特异性蝉颈苍驳与非特异性着色

全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：

（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。

（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（笔辞濒测尘别谤）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。

（3）顿础叠变质和显色时间太长：顿础叠最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的顿础叠不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与顿础叠产生反应而降低顿础叠的效力，未用完的顿础叠存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。顿础叠的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。

（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。

（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4?颁冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。

（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要么不显色要么背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

4.免疫组化染色呈阴性结果

1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；

2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6尘颈苍试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复；

3、组织切片本身这种抗原含量低；

4、血清封闭时间过长；

5、顿础叠孵育时间过短；

6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应；

7、开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

5.背景

1、考虑一抗浓度高；

2、然后调整顿础叠孵育时间；

3、也要考虑血清封闭时间是否过短；

4、适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。